| |
| |  |
Odkrycie wirusa HIV w krótkim czasie po pojawieniu się nie znanej wcześniej choroby, poznanie jego budowy i metod hodowli, pozwoliło na opracowanie laboratoryjnych metod diagnozowanie tych zakażeń. Miało to istotne znaczenie praktyczne, gdyż objawy zakażenia HIV mogą nie występować przez wiele lat. Podstawą tej diagnostyki są badania przesiewowe, wykrywające przeciwciała anty-HIV, będące odpowiedzią układu immunologicznego na zakażenie tym wirusem Rozpoznanie zakażenia opiera się w praktyce na stwierdzeniu obecności we krwi swoistych przeciwciał skierowanych przeciw wirusowi HIV. Są one dowodem czynnego zakażenia. Testy używane w laboratoriach, dość proste w wykonaniu, dostarczają wiarygodnych wyników. Pozwalają wykryć również zakażenia HIV przebiegające bezobjawowo, czyli bez żadnych zmian klinicznych. Przeciwciała anty-HIV pojawiają się po kilku tygodniach od zakażenia, zazwyczaj nie wcześniej niż po 6-8 tygodniach. Jeśli po 3 miesiącach od prawdopodobnego narażenia na zakażenie wynik badania nie potwierdza obecności przeciwciał, z zasady uznaje się, że do zakażenia nie doszło. Ujemny wynik testu wykonany wcześniej nie jest miarodajny i nie pozwala wykluczyć zakażenia. Niekiedy uzasadnione jest powtarzanie tych badań w okresie późniejszym. Do wykrywania przeciwciał anty-HIV używa się powszechnie testów immunoenzymatycznych (ELISA, EIA). Obowiązuje zasada, aby w razie dodatniego wyniku testu wykonać go tą samą metodą ponownie. Nawet jeśli obydwa dostarczą dodatnich wyników, nie wolno rozpoznać zakażenia HIV. W każdym takim przypadku wykonuje się jeszcze tzw. test potwierdzenia (Western Blot) w wyznaczonych ośrodkach referencyjnych. Mimo iż dostępne obecnie testy EIA tylko wyjątkowo dostarczają fałszywie dodatnich wyników, dopiero dodatni wynik badania testem Western Blot upoważnia do powiadomienia pacjenta o tym, że jest zakażony wirusem HIV. Zakażenie nie jest równoznaczne z chorobą. Szacuje się, że AIDS wystąpi u około połowy nosicieli wirusa w ciągu 10 lat od momentu zakażenia. Ponieważ nie tylko chorzy, lecz również nosiciele HIV mogą być źródłem zakażenia dla innych osób, wczesne rozpoznanie tych zakażeń odgrywa istotną rolę w zapobieganiu rozprzestrzeniania się HIV. / Poradnik (+) /
W testach anty-HIV znalazły zastosowanie różne rodzaje antygenów. Testy, w rozwoju historycznym, otrzymywały określenia numeryczne określające ich generację. Testy I generacji zawierały antygeny będące lizatami cząstek wirusa wyhodowanego na odpowiednich liniach komórkowych. Ponieważ w procesie przygotowywania tak uzyskiwanych antygenów wirusowych możliwe było zanieczyszczenie białkami pochodzącymi z komórek, na których hodowano wirusa, uzyskiwano wyniki fałszywie dodatnie. Testy II generacji zawierały antygeny HIV właściwe białkom wirusa, których ekspresją uzyskano metodą rekombinacji genetycznych (najczęściej w komórkach bakteryjnych), lub stosowano syntetyczne oligopeptydy złożone z 1540 aminokwasów. Testy III generacji zawierają ww. antygeny z tą różnicą, iż stosuje się w nich wariant testu ELISA, zwany metodą "kanapkową" (patrz niżej). Testy II i III generacji charakteryzuje wysoki stopień standaryzacji, precyzyjny dobór epitopów i wysokiego stopnia czystość antygenów, których liczba wynosi od 2 do 3.
/ Poradnik dla stomatologów /
| | | Zgodnie z przyjętymi oznaczeniami testy te noszą nazwę "enzyme immunoassays" (EIA) lub "enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA). Są uważane za tani i efektywny sposób przeprowadzania badań przesiewowych. ELISA jako metoda wykrywania anty-HIV może być skonstruowana w różny sposób; opracowano różne warianty tego testu do wykrywania anty-HIV. Najczęstsze zastosowanie, w różnych modyfikacjach, znalazły testy pośrednie ("indirect assay") oraz metoda kompetycyjna ("competitive assay"), a ostatnio metoda "kanapkowa". W odmianach tych antygeny wykrywające są umieszczone w fazie stałej. Przeciwciała znajdujące się w badanej surowicy u1egają związaniu z antygenem testowym. W metodzie pośredniej kompleks antygen-przeciwciało jest wykrywany po dodaniu przeciwciał przeciwko ludzkiej anty-IgG sprzężonej z enzymem (np. fosfatazą alkaliczną lub peroksydazą chrzanową), tak że po dodaniu odpowiedniego substratu reakcja enzymatyczna powoduje zmianę zabarwienia o natężeniu proporcjonalnym do liczby anty-HIV. W metodzie kompetetycyjnej badana surowice dodaje sie równoczesnie z anty-HIV znakowanym enzymem. W okresie inkubacji anty-HIV znajdujace sie w surowicy pacjenta wspólzawodnicza ze znakowanymi przeciwcialami testowymi o ogranicza liczbe miejsc wiazania antygenu umieszczonego w fazie stalej. W przypadku, gdy w badanej surowicy nie ma anty-HIV, wszystkie miejsca wiążące antygenu zajmują anty-HIV sprzężone z enzymem, co daje maksymalną absorbancję. Jeżeli natomiast w badanej surowicy są anty-HIV, wiążą się one z antygenem w proporcji zależnej od liczby anty-HIV, przez co reakcja barwna ma mniejsze nasilenie, aniżeli w próbce negatywnej. Tak więc, inaczej aniżeli w reakcji pośredniej, intensywność barwy w metodzie kompetycyjnej jest odwrotnie proporcjonalna do ilości anty-HIV obecnych w dodatniej próbce. W metodzie "kanapkowej" antygen opłaszczony w fazie stałej, wiąże anty-HIV z badanej próbki. W następnym etapie dodaje się podobny antygen związany z enzymem. W testach III generacji koniugat jest swoiście wiązany przez przeciwciała anty-HIV zarówno klasy IgG, jak i IgM. Daje to możliwość wcześniejszego wykrywania zakażeń HIV-1+2, średnio o 4-10 dni. Zwiększyła się przez to czułość badań. Szczegółowe opisy techniki stosowanej przez różnych producentów znajdują się w instrukcjach załączanych do zestawów. Testy wykrywajace anty-HIV-2 uzyskaly licencje FDA w 1990r. Od testów w kierunku anty-HIV-1 róznia sie rodzajem zastosowanych antygenów. Podobnie jak dla testów anty-HIV-1, stosuje sie tu rózne techniki diagnostyczne. Zaproponowano algorytm diagnostyczny, majacy na celu identyfikacje rodzaju wirusa. Jezeli po przeprowadzeniu testu przesiewowego, wynik jest dodatni, a w tescie uzupelniajacym , np. WB, ujemny lub nie okreslony, nalezy przeprowadzic test w kierunku anty-HIV-2. Opracowano takze testy uzupelniajace dla identyfikacji anty-HIV-2 (patrz nizej). Jednakże najbardziej wygodnym i popularnym rozwiązaniem stały się testy kombinowane: anty-HIV-1+2 zawierające odpowiednie zestawy antygenów. Przez to połączenie nie straciły one czułości w wykrywaniu przeciwciał przeciwko obu wirusom. Ostatnio w wykrywaniu anty-HIV znalazły także zastosowanie systemy automatyczne o bardzo skomplikowanych układach elektronicznych z rozbudowaną pamięcią skonstruowane przez różnych producentów. Są one wyposażone w bardzo szerokie możliwości diagnostyczne także z innego zakresu, zarówno zakażeń, jak i hormonów etc. Mogą mieć zastosowanie w laboratorium o małej, jak i bardzo dużej liczbie badań. Czas wykonania analizy, w zależności od systemu oraz prac przygotowawczych pomiędzy kolejnymi procedurami, wynosi od 30 minut do 3,5 godziny. / Poradnik dla stomatologów /  |  | ELISA - test immunoenzymatyczny
Wykrywa obecność przeciwciał anty-HIV | Płytka ELISA ujawniająca ujemne (jasne) i dodatnie (czerowne) wyniki testu w kierunku HIV |
|---|
/ Zakażenie HIV u kobiet /
| | | Metoda aglutynacjiSą to testy łatwiejsze do przeprowadzenia, aniżeli ELISA. Nie wymagają specjalnego oprzyrządowania. Znalazły zastosowanie w badaniach populacji z wysokimi wskaźnikami seropozytywności. Jako nośniki antygenów stosuje się że1atynę, lateks, heterologiczne i autologiczne erytrocyty. Są to testy o znacznej czułości, lecz mniejszej swoistości, względnie szybkie, z odczytem bezpośrednim, użyteczne w temperaturze otoczenia od +18 do + 30 oC. Test aglutynacyjny z zastosowaniem lateksu, na którym jest opłaszczony antygen HIV, ma czułość rzędu 95,2% i swoistość 96,1% w porównaniu z testem ELISA. Czas wykonania badania wynosi 10 minut, lecz odczyt nie jest zbyt łatwy. Test aglutynacji biernej ma małe zastosowanie poza Ameryką Łacińską. W porównaniu z poprzednim ma jeszcze mniejszą swoistość i czułość. / Poradnik dla stomatologów /
| | | W teście aglutynacji cząsteczkowej ("particle agglutination assay") przeciwciała przeciwko ludzkiej IgG (faza stała) wychwytują IgG (także anty-HIV) w badanej próbce. Następnie dodaje się zawiesiny cząstek żelatyny opłaszczonych antygenem HIV. Jeżeli w badanej próbce są anty-HIV - cząstki przylegają do powierzchni płytki (adherencja), na której znajduje się kompleks anty-IgG/anty-HIV. Jest to test nieco mniej czuły i swoisty aniżeli test ELISA, jednakże różnice nie są tu zbyt duże, a czułość może być nawet wyższa we wczesnych okresach serokonwersji. Test ten zastosowano także do badań moczu. / Poradnik dla stomatologów /
| | | Antygen (rekombinat, peptyd syntetyczny) jest umieszczany w postaci małych kropek ("dot "), zawierających duże stężenie HIV Ag (może to być HIV-1 obok HIV-2), na błonie nitrocelulozowej. Odczyt następuje na podstawie zmiany barwy utworzonego kompleksu Ag/Ab. Test jest szybki (3-10 min) i nadaje się do zastosowania wówczas, gdy chodzi o uzyskanie wyniku w bardzo krótkim czasie. / Poradnik dla stomatologów /
| | | Inne szybkie testySą to testy, których czas wykonania wynosi od 10 do 15 minut. Antygeny HIV są umieszczone na błonach, a zasada testu jest oparta na metodzie ELISA. Wykrycie kompleksów immunologicznych po reakcji z ludzką anty-IgG polega na odczycie precypitacji, widocznej na błonie w postaci odpowiednio zabarwionego prążka - przez porównanie z kontrolą. Czułość wynosi od 95% do 99,8%, a swoistość od 95% do 99%. / Poradnik dla stomatologów /
| | | Inne testy przesiewoweSystem Abbotta IMX wykrywa anty-HIV za pomocą fluoroscencyjnej metody wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało. Jest to metoda podobna do testu ELISA; czas wykonania wynosi 15 min. Zastosowano także (SimpliRed test) autologiczne krwinki czerwone wykazujące aglutynację (badanie na pełnej krwi) w przypadku obecności anty-HIV. Odczynnik zawiera przeciwciała przeciwko antygenom grupowym erytrocytów w kompleksie z syntetycznym peptydem gp 41. / Poradnik dla stomatologów /
| | | Testy serologiczne potwierdzające (badania weyfikacyjne)Na podstawie badań przeprowadzonych na dużej liczbie surowic - pochodzących od osób o małym ryzyku zakażenia - wyniki fałszywie dodatnie w testach kombinowanych, ELISA i WB stwierdzono w proporcji mniejszej aniżeli 1:100 000. Istotnym problemem diagnostycznym są tzw. wyniki "nieokreślone". Tego rodzaju wzorce (np. reakcja tylko z p17 lub tylko z p24) może występować w około 15% badań z użyciem WB. Jeżeli tego typu wzorce nie zmieniają się przez wiele miesięcy, nie oznacza to zakażenia HIV. U osób tych nie wykazano obecności prowirusa HIV przy zastosowaniu metody PCR. Okres obserwacji przekraczał w wyżej cytowanych badaniach pół roku. Na tyle określa się konieczny okres nadzoru, w którym trzeba powtórzyć test. Jeżeli nie pojawiają się dodatkowe pasma pozytywne, prawdopodobieństwo zakażenia jest minimalne. W materiale polskim ujemne wyniki badań weryfikacyjnych w teście Western-blot, a więc wyłączenie zakażeń HIV, mimo dodatnich wyników w testach przesiewowych, uzyskano w 12,1% przy drugiej generacji i 14,8% przy trzeciej generacji. Odsetki wyników nie rozstrzygniętych wynosiły odpowiednio 23,2% i 11,8% (w opracowaniu tym - "Serologiczna diagnostyka zakażeń HIV" Z. Selibórka - łączna liczba badań w różnych grupach w zależności od ryzyka zakażenia wynosiła 1265). / Poradnik dla stomatologów /
| | | Western-blotJest najczęściej stosowanym testem uzupełniającym. Wykorzystuje się w nim możliwość określenia reaktywności antygenów HIV umieszczonych oddzielnie na pasku nitrocelulozowym lub na innym podłożu, w celu uwidocznienia reakcji z anty-HIV w badanej surowicy. Białka HIV są ułożone wg ich ciężaru cząsteczkowego (od gp160 do p17). Po zadaniu badaną surowicę i wypłukaniu nie związanego materiału, paski inkubuje się z kozią surowicą zawierającą przeciwciała przeciwko ludzkiej IgG sprzężone z enzymem (peroksydaza chrzanowa lub fosfataza alkaliczna). Reakcja pozytywna, po dodaniu odpowiedniego substratu, uwidacznia się w postaci zabarwionych pasemek. W teście tym, jako pierwsze po zakażeniu ujawniają się anty-HIV przeciwko białku kodowanemu przez region gag; zanikają one w okresie wystąpienia objawów klinicznych. Natomiast anty-HIV przeciwko glikoproteinie otoczki oraz białku przezbłonowemu wykrywa się we wszystkich fazach zakażenia. Można także stwierdzić anty-HIV przeciwko produktom genu pol, a rzadziej - tat, vif, nef i innym białkom gag.  Stosuje się różne kryteria interpretacyjne. Niektóre z nich są bardzo restrykcyjne, jak np. firmy Ortho/DuPont, gdzie - aby wynik uznać za dodatni - reakcja musi dotyczyć p24, p31 gp41 lub gp120/gp160. Światowa Organizacja Zdrowia ustaliła swe kryteria w zakresie HIV-1 na dwa wyniki dodatnie odnośnie do białek env z (lub bez) dodatnim wynikiem z gag lub pol, a dla HIV-2 również dwa wyniki dodatnie z białkami otoczki z (lub bez) gag lub pol. / Poradnik dla stomatologów /
Wyniki testu Western-Blot (wg zdjęcia):
- niepewny
- słabo dodatni
- wyraźnie dodatni
/ Zakażenie HIV u kobiet /
| | | Line immunoassay (LIA) różni się tym od testu WB, iż antygeny nie są umieszczone na pasku testowym w technice rozdziału elektroforetycznego, lecz nakładane w postaci rozdzielonych prążków. Są to antygeny rekombinowane i/lub peptydy syntetyczne. W teście tym można umieścić optymalne ilości antygenów, co ułatwia odczyt (wg wzorców) i interpretację. Można również w układzie wykrywającym uwzględnić antygeny HIV-1 i HIV-2. Test nadaje się do oznaczeń w surowicy, plazmie i pełnej krwi. / Poradnik dla stomatologów /
| | | Test imunofluorescencyjnyJest tańszy od testu WB, lecz wymaga doświadczonego oka w ocenie wyników. Zakażone HIV limfocyty utrwala się na szkiełku podstawowym wraz z kontrolą w postaci limfocytów nie zakażonych. Surowicę badaną inkubuje się z preparatami komórkowymi, a następnie z fluoresceiną sprzężoną z przeciwciałami przeciwko ludzkiej IgG. Anty-HIV wiążą się z antygenami wirusa w zakażonych limfocytach, co daje możliwość policzenia odsetków komórek wykazujących fluorescencję i jej typ. / Poradnik dla stomatologów /
| | | Limfocyty hoduje się w medium zawierającym aminokwasy znakowane pierwiastkami radioaktywnymi. Lizaty z tych komórek inkubuje się z badaną surowicą. Po niezbędnych procedurach pośrednich - odczyt polega na wykrywaniu kompleksów immunologicznych zawierających pierwiastek promieniotwórczy. / Poradnik dla stomatologów /
| | | Zmodyfikowany test WB zawiera w swym składzie liczne antygeny HIV-1 oraz jeden antygen swoisty dla HIV-2 (gp36 lub gp41). Test INNO-LIA zawiera natomiast trzy rekombinowane białka HIV-1 (p24, p17 i p31), dwa syntetyczne peptydy (gp41) oraz jeden antygen HIV-2 (gp36). Kombinowany test uzupełniający "MATRIX" (Abbott) jest oparty na systemie półautomatycznym z wykorzystaniem metody plamkowej ("dot-blot"). / Poradnik dla stomatologów /
| | | Są to liczne metody umożliwiające hodowlę wirusa z różnego materiału, badanie obecności jego produktów antygenowych oraz znajdowanie kwasu nukleinowego w płynach i w tkankach. Konsekwencją tych badań jest określenie fazy zakażenia, a przede wszystkim możliwość oceny nasilenia replikacji wirusa zarówno w tkankach (np. w węzłach chłonnych), jak i w plazmie (wiremia). Na tym polu dokonał się w ostatnich latach znaczny postęp. Wykrycie wiremii umożliwia wczesne rozpoznanie zakażenia u noworodków urodzonych z matek HIV+. Swoistość i czułość pomiarów ilościowych zalety od ilości materiału wirusowego (faza zakażenia), jak i rodzaju testu, którego nie należy traktować jako badanie rutynowe. / Poradnik dla stomatologów /
| | | Hodowlę wirusa prowadzi się z płynów ustrojowych (przede wszystkim z plazmy) oraz z komórek wrażliwych na zakażenie HIV. Czas trwania hodowli wynosi od 2 do 6 tygodni. Wyniki zależą od wielu czynników, takich jak rodzaj materiału (świeży, mrożony), rodzaj zastosowanego czynnika przeciwkrzepliwego, a także techniki hodowli. Niezależnie od zastosowanej metody, częstość dodatnich hodowli oraz miano wirusa wzrastają wraz z postępem choroby, zmniejszaniem się liczby limfocytów CD4 oraz wykrywalności HIV Ag. Częstość dodatnich hodowli wynosi od 56% do 100%, przy czym prawie wszyscy chorzy z ARC lub AIDS wykazują wyniki dodatnie, natomiast nie u wszystkich bezobjawowych nosicieli udaje się uzyskać pozytywny wynik. Od czasu pierwszych hodowli HIV z komórek z krwi obwodowej udoskonalono metodę, która obecnie umożliwia wykrycie HIV u przeszło 90% osób HIV+. Jako wskaźnik zakażenia stosuje się tu pomiar p24 w nadsączu I wykrywanie aktywności rewertazy. / Poradnik dla stomatologów /
| | | Klasyczną metodą jest polimerazowa reakcja łańcuchowa, nazywana także reakcją łańcuchową polimerazy (PCR). Natomiast hybrydyzacja in situ, stosowana do wykrywania materiału genetycznego wirusa w komórkach i w tkankach przy zastosowaniu sond genetycznych, jest w porównaniu z PCR o wiele mniej czuła. 0 ile przy użyciu pierwszej z nich można było wykryć od 1:100 do 1:1000 limfocytów CD4 zakażonych HIV, o tyle metodą hybrydyzacji tylko 1:10 000-1:100 000. PCR wymaga przeprowadzenia trzech etapów (niezbędne jest zastosowanie odpowiednio dobranych, wzorcowych odcinków poszukiwanego RNA lub DNA, tzw. prymerów): ekstrakcji, amplifikacji i uwidocznienia wykrytego kwasu nukleinowego. PCR dla oznaczenia obecności RNA wirusowego wymaga konwersji RNA w cDNA, czego dokonuje się przy zastosowaniu odwrotnej transkryptazy, amplifikacja natomiast odbywa się przez użycie odpowiedniej polimerazy DNA. PCR znalazła zastosowanie w wielu sytuacjach, takich jak wykrywanie kwasu nukleinowego wirusa w plazmie, komórkach, płynach ustrojowych, u noworodków urodzonych z zakażonych matek, a także u osób seronegatywnych, znajdujących się w grupach wysokiego ryzyka zakażenia HIV. Metoda ta jest stale udoskonalana, m.in. dzięki stosowaniu sekwencji wewnętrznych, niezbędnych do badań i1ościowych (zewnętrzne wystarczają w badaniach ilościowych). Konieczność bardziej precyzyjnych oznaczeń ilościowych stymulowała badaczy do wprowadzenia nowych rozwiązań 1aboratoryjnych. W zakresie PCR, są to takie modyfikacje, jak PCR in situ i PCR kompetycyjna. W pierwszej z wymienionych, amplifikacji dokonuje się wewnątrz odpowiednio spreparowanych, wyizolowanych komórkach. Dzięki niej bardzo dokładnie określa się odsetki komórek zawierających materiał genetyczny HIV, których jest dziesięciokrotnie więcej, aniżeli opisywano to przy zastosowaniu poprzednio używanych technik. Opracowano także metodę kombinowaną: PCR in situ z cytometrią przepływową. W drugiej z wyżej wymienionych DNA HIV-1 oznacza się ilościowo poprzez kompetycję z fragmentem DNA zmutowanego HIV-1 o znanym stężeniu (odpowiednie rozcieńczenia). Metoda nie wymagająca ekstrakcji i amplifikacji enzymatycznej to test amplifikacji sygnału rozgałęzionego DNA (proponowana nazwa polska), branched DNA signal amplification assay (w skrócie bDNA; "Quantiplex HIV-RNA", Chiron Corporation). Test jest oparty na zasadzie hybrydyzacji syntetycznych oligonukleotydów komplementarnych do poszukiwanych sekwencji genomu HIV. Utworzony kompleks hybrydyzuje z syntetycznymi, rozgałęzionymi cząsteczkami DNA (bDNA). Powstały kompleks trójskładnikowy inkubuje się z substratem o właściwościach chemiluminescencyjnych, co umożliwia pomiar nasilenia reakcji. Inny test, naprzemiennej amplifikacji sekwencji kwasów nukleinowych (proponowana nazwa polska) nucleic acid sequence-based amplification (NASBA, Organon-Teknika) polega na dołączeniu do RNA znajdującego się w badanej próbce, prymera zawierającego promotor T 7, a następnie syntezy komplementarnego DNA za pomocą rewertazy wirusa mieloblastozy ptasiej (AMV-RT). Pierwotny łańcuch RNA degraduje się RN-azą H. Na matrycy otrzymanego cDNA, AMV-RT syntetyzuje komplementarny łańcuch DNA. Polimeraza T 7-RNA syntetyzuje antysensowną nić RNA. Produkty reakcji można wykryć metodą standardową (prążki na żelu w świetle / Poradnik dla stomatologów /
| | | © 1998 SONAR | |
|
|
